本文是一篇医药学论文，本研究成功分离出了40株大肠杆菌临床菌，药敏结果表明，腹泻绵羊大肠杆菌临床菌株对金霉素的敏感率为12.5％，中介率为57.5％，耐药率为30％，其中敏感率与中介率共达70％，表明金霉素目前在当地绵羊大肠杆菌导致的腹泻性疾病防治中具有较好的临床抗菌效果。
1 前言
1.1 金霉素抗菌活性研究
金霉素为广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和链球菌）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌）及原虫等均具有抑制作用，其中对于大肠杆菌抗菌活性的研究，国内学者张雅为（2017）在研究金霉素、四环素、土霉素、脱氧土霉素、强力霉素及多西环素共6种四环素类抗菌药物对大肠杆菌临床分离菌抗菌活性的研究中，发现金霉素对33株临床分离的大肠埃希菌最小抑菌浓度值（Minimum inhibitory concentration，MIC）值为0.5～16 μg/mL，即MIC值为0.5 μg/mL，同时四环素、土霉素、脱氧土霉素、强力霉素及多西环素的MIC值分别为1、2、0.25、0.5和0.25 μg/mL，表明金霉素与脱氧土霉素、强力霉素及多西环素等均对大肠杆菌具有较强的抗菌活性。其他几种四环素类抗菌药物对大肠杆菌体外抑菌值见表1.1。
1.2 金霉素在临床养殖中的药效学研究
金霉素在养殖生产中，由于其具有抗菌谱广、配伍禁忌少、价格低廉，给药方便等优点，因此被广泛用于兽医临床中动物疾病的防控，通常用于预防和治疗羔羊痢疾、犊牛腹泻、母猪消化道及呼吸道疾病、断奶仔猪腹泻以及鸡白痢和滑液囊支原体病等。有研究表明金霉素在怀孕母羊流产性疾病的防治中效果显著，国外学者Wiedmann（1999）等在爆发单核增生李斯特菌而引发的怀孕母羊流产性疾病中，通过在饲料中添加500 mg/头/d剂量的金霉素对所有母羊进行防治，最终养殖场流产得到了有效控制。肖定福（2011）等通过在大肠杆菌攻毒3 d后的仔猪（腹泻率为100％）基础饲粮中添加50 mg/kg金霉素，持续饲喂给药21 d，发现用金霉素饲喂治疗组仔猪腹泻率比感染组腹泻率要低20％左右，表明金霉素对于大肠杆菌导致的断奶仔猪腹泻具有明显的治疗效果。
金霉素在禽畜及反刍动物（牛、羊）生产性能的促进中也发挥了重要作用，但主要体现在幼龄动物上。国外学者在犊牛日粮中添加35 mg/kg金霉素，饲喂时间持续56 d，结果发现饲喂添加金霉素日粮组的犊牛日增重明显高于对照组（Beacom et al., 1988）。国内学者通过在肉仔鸡饲粮中添加150 mg/kg金霉素，持续饲喂7周后对肉仔鸡进行称重，发现持续饲喂150 mg/kg剂量金霉素组的肉仔鸡较对照组增重明显，表明饲粮中持续低剂量添加金霉素对雏鸡生产性能具有促进作用（佟建明等，2001）。有研究表明，通过在饲粮中添加75 ppm金霉素，持续饲喂21 d后对其称重，结果发现金霉素能显著促进断奶仔猪增长，降低仔猪腹泻率及死淘率（程旭东等，2005）。
2 材料与方法
2.3 溶液配制
20 mg/mL CTAB裂解液：准确称取2 g CTAB和8.18 g氯化钠，倒入装有10 mL 1 M Tris-Hcl缓冲液（pH=8.0）的烧杯中，加热溶解，然后加入4 mL 0.5 M EDTA（pH=8.0）溶液，最后转移至100 mL容量瓶中进行定容，121℃高压灭菌15 min后室温保存。
酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）：分别量取 50 mL、48 mL及2 mL的酚、氯仿及异戊醇溶液，倒入玻璃瓶中混匀后4℃保存。
70％冰乙醇溶液：量取无水乙醇70 mL，用纯化水稀释至 100 mL后，于-20℃保存。
LB/AMP+/IPTG/X-gal固体培养基：准确称取5 g酵母提取物，10 g胰蛋白胨、15 g琼脂粉及10 g氯化钠于1 L锥形瓶中，加入950 mL去离子水后进行搅拌溶解，用5 M NaOH溶液调节pH至7.0后，加入去离子水定容至1 L，121℃高压灭菌15 min后冷却至55～60℃，再加入 1 mL 氨苄青霉素（100 mg/mL）、0.48 mL IPTG及0.8 mL X-Gal后混匀，快速倒入培养皿中，于洁净台冷却凝固后，4℃保存。
2.4 腹泻绵羊大肠杆菌临床菌敏感性研究
为了客观、科学地评价金霉素对腹泻绵羊大肠杆菌临床分离菌的体外抑菌效果，为下一步临床药动、药效实验的开展提供科学合理数据，本试验于2019年12月～2020年1月对内蒙古自治区兴安盟乌兰浩特市周边多个绵羊养殖场的腹泻绵羊进行腹泻粪便样品采集，采用琼脂稀释法测定金霉素对大肠杆菌的临床分离株的最小抑菌浓度（MIC）。
2.4.1 样品采集
无菌采集腹泻羔羊、断奶羔羊直肠拭子及其粪便等病料。腹泻羔羊的选择依据：羔羊臀部局部区域被粪便污染、排粪便次数明显增多、粪便形状改变呈半液样或/和稀粥样、粪便颜色异常呈黄色或灰黄色且带有气泡、可能带有粘液及血液或粪便气味异臭，羔羊精神状态异常且伴有腹痛、拱背、咩叫、怒责、虚弱卧地等现象，一般满足其中一种现象即为腹泻。
2.4.2 初步分离及纯化
将采集的腹泻羔羊直肠拭子及其粪便等病料划线于麦康凯琼脂培养基，于37℃恒温培养箱培养12 h后，挑取菌落大小在1～4 mm 之间, 单个菌落呈深红色、红色或浅红色， 菌落圆形、隆起、湿润、光滑且边缘整齐的疑似菌落进行纯化培养两次。
3 结果 ····························· 24
3.1 腹泻绵羊大肠杆菌临床菌敏感性研究结果 ················ 24
3.1.1 初步分离纯化及镜检结果 ····················· 24
3.1.2 生化鉴定结果 ························ 25
4 讨论 ······················· 41
4.1 腹泻绵羊大肠杆菌临床分离菌的药物敏感性试验 ················· 41
4.1.1 国内各地区绵羊大肠杆临床分离菌药物敏感性分析 ··············· 41
4.1.2 腹泻绵羊大肠杆临床分离菌对各抗菌药物敏感性分析 ················· 41
5 结论 ·························· 46
4 讨论
4.1 腹泻绵羊大肠杆菌临床分离菌的药物敏感性试验
4.1.1 国内各地区绵羊大肠杆临床分离菌药物敏感性分析
关于羊源大肠杆菌临床分离菌药物敏感试验，国内学者对不同地区羊源大肠杆菌临床分离菌展开了大量研究。夏利宁（2014）等采用微量肉汤稀释法，对新疆某规模化羊场分离的638株健康羊源大肠杆菌临床菌株进行了9种临床常用抗菌药物的药物敏感性试验，结果表明临床分离菌株对9种抗菌药物均表现出不同程度的耐药，其中对阿莫西林及安普霉素耐药率分别达到21.2％及33.9％，阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、头孢噻呋、氨苄西林及恩诺沙星等其他6几种抗菌药物耐药率在7.5％～15.6％之间，而氟苯尼考敏感率高达96.9％。谢秀兰（2017）等从宁夏地区采集到90份腹泻羔羊粪便拭子，采用K-B制片扩散法对78株羊源大肠杆菌临床菌进行药物敏感性试验后，结果表现为对头孢类抗菌药物均具有较低耐药性，对氨基糖苷类抗菌药物中的庆大霉素敏感率为78.21％，同时对四环素的药物敏感率也仅为62.82％，表明宁夏地区腹泻羊源大肠杆菌临床分离菌耐药并不严重。姜德相（2018）等采用K-B纸片法，对吉林白城地区腹泻羔羊粪便样品中分离出的56株致病性大肠杆菌进行了16种抗菌药物的药物敏感性试验，结果表明其对头孢曲松和头孢克肟等两种头孢内抗菌药物较敏感，耐药率仅为12.4％～28.6％，而对强力霉素、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、大观霉素、林可霉素、多粘菌素、青霉素、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考和丁胺卡那霉素均表现出较高的耐药率，庆大霉素耐药率为67.9％，多粘菌素的耐药率为62.5％，说明白城地区羊源大肠杆菌临床菌耐药现象特别严重，甚至对临床治疗最后防线药物多粘菌素已经产生了高度耐药性。
5 结论
在腹泻绵羊大肠杆菌临床分离菌的分离鉴定及药敏试验中，本研究成功分离出了40株大肠杆菌临床菌，药敏结果表明，腹泻绵羊大肠杆菌临床菌株对金霉素的敏感率为12.5％，中介率为57.5％，耐药率为30％，其中敏感率与中介率共达70％，表明金霉素目前在当地绵羊大肠杆菌导致的腹泻性疾病防治中具有较好的临床抗菌效果。
在金霉素微囊化颗粒对绵羊瘤胃菌群数量的影响中，普通金霉素预混剂和其他4组金霉素微囊化颗粒与空白组相比对绵羊瘤胃细菌数量均有影响，但氢化油：单甘脂（9:1）处方组金霉素微囊化颗粒仅对牛链球菌有降低趋势（P<0.05），对绵羊瘤胃微生物菌群数量影响较小；4组金霉素微囊化颗粒与普通金霉素预混剂相比，氢化油：单甘脂（9:1）处方组金霉素微囊化颗粒相对于普通金霉素预混剂有较好效果，对绵羊瘤胃微生物菌群数量影响较小。因此，本研究筛选出的氢化油：单甘脂（9:1）处方组金霉素微囊化颗粒能在一定程度上克服现有普通金霉素预混剂在反刍动物临床应用上的缺陷，减少对绵羊瘤胃菌群数量的影响，可作为一种合适的处方进行参考或为后续研究提供科学依据。
参考文献（略）
