本文是一篇临床医学论文，本研究从转录组测序结果中选取TNFRSF10C、XAF1基因进行荧光定量PCR验证。这两个基因均与肿瘤细胞凋亡相关，且在正常组织中普遍表达，在肿瘤组织中低表达。
1 前言
1.1 EGFR的概述
EGFR是ErbB家族的重要成员，这个家族其它三位成员分别为HER2、HER3、HER4[12]。EGFR包含28个外显子，分子量为170KDa，基因位于7号染色体，7p12区，在不同的正常上皮来源组织中都可检测到该基因表达[13]。EGFR由三个主要部分构成：胞外EGF结合域、跨膜区和胞内结构域[14]。胞内结构域进一步可细分为两个亚基：蛋白酪氨酸激酶（PTK）结构域和C末端磷酸化结构域。当EGF或其他类似EGFR的配体，如TGF-α，与EGFR结合后，下游信号通路被启动[15]。EGFR的表达量在正常细胞中大约为40，000-100，000个不等，所以EGFR的激活在多种细胞生物进程中至关重要，其中包括组织的发育、维持和修复，以及癌症细胞的增殖和转移。但是当EGFR的表达或活性失控时，就会导致细胞增殖过度、血管生成、侵袭和转移等癌症相关的现象[16]，所以EGFR成为许多癌症治疗策略的重要靶标[17, 18]。EGFR基因在NSCLC中经常发生突变或扩增，导致其酪氨酸激酶活性增强或二聚化能力增强，在NSCLC患者中，10-30%的患者携带有EGFR的激活突变[19]。因此，EGFR被认为是NSCLC治疗的重要靶点.
1.1.1 EGFR的信号通路
EGFR位于细胞表面，与其配体结合成二聚结构从而被激活。EGFR的配体主要包括表皮生长因子（EGF）和转化生长因子α（TGF-α）。除了这两种主要的配体外，β-细胞素（BTC）、双向调节蛋白（AR）、表皮调节素（EPR）以及肝素结合EGF样生长因子（HBEGF）等同样不可忽视。这些配体在表皮生长因子受体（EGFR）的信号传导过程中均扮演着举足轻重的角色，对于细胞功能的调节和维持具有关键性影响[20]。EGFR位于肿瘤发生的最重要信号通路之一的前端，在EGFR控制下的众多通路中，每一条都具有驱动细胞增殖和对抗细胞凋亡的强大能力。其中，EGFR控制的下游的信号通路主要两条，其中一条是MAPK途径（Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK）。MAPK是真核生物中一类高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，其所介导的信号通路在真核生物的信号传递过程中占据关键地位，对于维持细胞的正常功能至关重要。
1.2 EGFR抑制剂
EGFR-TKIs属于小分子药物，其遏制肿瘤细胞增殖的主要作用机制是通过与细胞内的酪氨酸激酶区结合，有效地阻断EGFR的信号传导通路，从而发挥作用。相比传统一线化疗药物卡铂和紫杉醇，EGFR-TKIs对EGFR突变的晚期NSCLC患者有更好的治疗效果[38]。目前市面上一共有三代EGFR-TKIs。
1.2.1第一代EGFR-TKIs
当今已上市的第一代EGFR-TKIs主要有三种。吉非替尼（Gefitinib，图1-1a）是由英国阿斯利康公司研发与生产的，它更为患者熟知的名字是易瑞沙，于2003年美国FDA（食品药品监督管理局）批准上市。厄洛替尼（Erlotinib，图1-1b）是由美国罗氏-基因泰克公司研发生产，2004年获美国FDA批准上市，它更为患者熟知的名字是特罗凯。两者均具有喹唑啉结构母核，喹唑啉是它们二者与EGFR结合可逆性的核心骨架，主要以ATP竞争性的方式可逆结合EGFR[39]。相比化疗与放疗，它们具有更高的药物反应率，接受治疗的大部分患者都能有效地控制癌症的进一步发展，从而大大地延长了病人的寿命。
埃克替尼（Icotinib，图1-1c）为浙江贝达自主研发，有“国产易瑞沙”之称，商品名为凯美纳，结构与厄洛替尼相似[40]。埃克替尼也是一种可逆的与ATP结合的EGFR抑制剂，它同样以喹唑啉为母核。研究发现，与吉非替尼相比，埃克替尼的毒性更小，患者耐受性更好[41]。虽然埃克替尼并未获得美国FDA的批准，但是在2014年11月13日，中国正式批准埃克替尼作为EGFR突变NSCLC患者的首选临床治疗方案。尽管第一代EGFR-TKIs对于EGFR 19del和EGFR L858R这两种常见EGFR突变的一线治疗临床效益可观，但EGFR突变的NSCLC患者在用药后9-14个月内可能出现耐药。
2 细胞系的建立与培养
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株、菌株来源
2.2 质粒的改造和提取
2.2.1 质粒的改造
本研究设计通过慢病毒包装方法，用H1975细胞构建H1975L858R/T790M/C797S稳转细胞系[59]，此研究使用到的含有EGFR C797S蛋白基因的pLenti-EF1α（G+）质粒由本实验室保存。由于后续实验需要排除GFP片段绿色荧光的干扰，所以我们首先需要将此质粒的GFP片段切除。
（1）酶切
（3）转化
① 将感受态细胞从冰箱里拿出解冻，放在提前准备好的冰盒上静止10-15 min，取10 μL体系加到感受态细胞悬液中混匀，然后放回冰上继续反应30 min。
② 提前金属浴仪升温到42℃，30 min后迅速转移至仪器上热激，计时1 min后立即放回冰盒上冷却2 min。
③ 提前准备好灭完菌的LB液体培养基，然后在超净台紫外操作台上将感受态细胞悬液内加入900 μL，在180 r/min，温度 37℃的条件下，摇床震荡45 min。
④ 在完成震荡步骤后进行离心处理，确保沉淀的菌体与上清液有效分离，在离心管内加入200 μL LB培养基以充分重悬并均匀混合沉淀物，随后将转移到一个预先准备好的、含有氨苄青霉素的无菌LB平板培养基中。
⑤ 使用无菌涂布玻璃珠数颗，上下左右轻轻晃动培养皿将菌液均匀涂布于培养皿内。之后，将培养皿正面朝上放入37℃培养箱中静置60min，以确保皿内液体完全凝固并停止流动状态。随后，将培养皿翻转至底部朝上，并继续将其置于37℃培养箱中培养12-16 h。在此期间，单个细菌细胞会经历生长和增殖，最终形成肉眼可辨识的单菌落结构。
3 H1975、H1975L858R/T790M/C797S对第三代EGFR-TKIs敏感性的体外分析 ............... 19
3.1 实验材料 ................................. 19
3.1.1 化合物来源 ................................. 19
3.1.2 主要试剂和仪器 ...................... 19
4 H3255、H1975、H1975L858R/T790M/C797S对BDTX-189敏感性的体外分析 ................. 25
4.1实验材料 .......................... 25
4.1.1 主要试剂和仪器 .......................... 25
4.1.2 主要实验耗材 ................ 26
5 全文总结 ........................ 53
4 H3255、H1975、H1975L858R/T790M/C797S对BDTX-189敏感性的体外分析
4.1实验材料
4.1.1 主要试剂和仪器
为了检测BDTX-189对H3255、H1975、H1975L858R/T790M/C797S细胞的影响，将三种细胞系分成对照组和用药组，其中对照组（Control组）用不含有BDTX-189的RPMI 1640完全培养基处理，用药组分别用含有浓度0.2 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、5 μM BDTX-189的RPMI 1640完全培养基处理细胞，或者单独用含有浓度为1 μM BDTX-189的RPMI 1640完全培养基处理细胞。
5 全文总结
研究表明，EGFR突变在肺癌患者当中占比非常高，接近60%，这说明有更多的患者可以通过靶向治疗来治疗肺癌[68]。针对有EGFR突变的肺癌患者，选择EGFR靶向药治疗以后，患者的生存时间大幅度延长，同时生活质量也有明显的改善。但是耐药性是肺癌患者接受靶向治疗中一个不可忽略的问题，一线使用一代或者二代EGFR-TKIs治疗耐药后，60%的患者重新基因检测后会出现T790M突变[69]。针对这一问题，以AZD9291（奥希替尼）为代表的三代TKIs应运而生，但是经过一段时间的治疗也会不可避免的产生EGFR C797S突变的耐药性[70]。
本文的创新点之一是通过慢病毒包装的方法构建EGFR L858R/T790M/C797S三重突变的细胞系来进行药物的敏感性验证。我们首先用MTT实验与平板克隆实验来验证三种血药浓度下的三代EGFR-TKIs对H1975和H1975L858R/T790M/C797S细胞的增殖能力，以此作为本实验的对照，结果表明目前市面上的三种TKIs能够很好的抑制双重突变H1975细胞的活性，但是对于三重突变H1975L858R/T790M/C797S细胞却无抑制作用，这一点也很好的证明了我们三重突变耐药细胞株构建成功。然后我们利用药物处理过的三重突变细胞的RNA进行转录组测序，与对照组相比结果表明，上调的差异表达基因有779个，下降的差异表达基因有284个。同时GO富集结果分析证明BDTX-189处理后的差异细胞基因表达与细胞增殖，细胞凋亡与蛋白质的结合有关，此结果有利于我们下一步的验证研究。
参考文献（略）
