本文是一篇临床医学论文，本实验验证了其对维奈克拉耐药AML细胞的侵袭力的影响，结果表明耐药细胞的迁移以及侵袭力较亲本细胞上升，且敲除ADAM15后，迁移和侵袭能力下降，表明ADAM15与细胞的迁移和侵袭能力正相关。
第一章 绪论
1 AML的流行病学现状
根据去年的统计数据，在我国，白血病的新发病例数在所有新诊断的恶性肿瘤中1.7 %，而死亡数占1.9 %[1]。在所有成人血液系统恶性肿瘤中，AML的发病率最高，每年每 10 万人群就中有 4.1 例AML新发病例[2]。且其发病率随着年龄的增长而增加，根据NIH在2022年进行的对全球、全人种数据的统计，AML的中位诊断年龄为69岁，其中有大于75% 的病例诊断年龄在 55 岁或以上，有大于60 %的病例诊断年龄在65岁以上[3]。AML的预后很差，其5年相对生存率仅为37.1 %，中位死亡年龄为73岁[2]。可以预见，在人口老龄化的趋势下，这个比例将会越来越高，故优化AML的诊疗策略，在增加病人的生存几率的同时减少治疗相关毒副作用、提升病人的生活品质已经刻不容缓。
2 AML的治疗现状
AML 是一组异质性血液系统恶性肿瘤，由骨髓中髓系造血前体细胞的病理性克隆扩增引起。不仅在外周血中可见循环白血病细胞（也称为原始细胞），而且病态造血引起的粒细胞减少、贫血和血小板减少也很常见，因为增殖的白血病细胞会干扰正常的造血功能，继而引起贫血、感染、凝血异常等临床症状。在AML的治疗中，主要的治疗目标是通过积极的治疗实现完全缓解（Complete Remission, CR），研究表明，部分缓解（Partial Remission， PR）不会带来实质性的生存获益。经过适当的诱导治疗后，大约60 % 至70 % 的成人AML有望达到CR状态。超过 25 % 的 AML 成人患者（约 45 % 获得CR的患者）预计可存活 3 年或更长时间并可能被治愈[4]。如果治疗没有达到完全缓解率或发生了缓解后复发，患者的预后会很差。然而，AML的诱导缓解率与诊断年龄成反比[5]，中老年人，尤其是65岁以上的患者常常因为机体功能的衰老以及各种合并症的叠加，常常不能耐受强化疗和移植，这使老年AML患者治疗方案的选择很局限，其治疗有效率不到50%[6,7]。同时，还有学说认为，老年患者因为造血系统中细胞的衰老以及骨髓微环境中衰老因子的累积，治疗反应率不高且无病生存期相对更短[8]。同时，传统化疗及其引发的血细胞减少、免疫系统受损、凝血功能低下等毒副作用也大大增加了各年龄层患者的治疗风险[9]。开发有效的疗法来提高缓解率和改善复发后生存率仍然是 AML 治疗的首要任务。
第二章 维奈克拉耐药AML细胞系的建立及BH3分析
1 引言
耐药细胞系的诱导常用的方法有单克隆法和低剂量持续诱导法。单克隆法通过极限稀释法在96孔板中形成单个细胞，使细胞暴露于高浓度药物中，挑选能存活的单克隆株不断扩增，最终形成耐药的单克隆细胞。低剂量持续诱导法一开始用低浓度的药物作用于需要诱导耐药的细胞，随后换成不添加药物的培养基让其种群扩增到一定数量后，再次增加药物的浓度，通过持续不断的增加药物浓度诱导出多克隆的耐药细胞。本实验先筛选出对维奈克拉敏感的细胞株，再使用低剂量持续诱导法诱导维奈克拉耐药的AML细胞系。
维奈克拉是BCL-2蛋白选择性抑制剂，具有高度选择性，单一抑制BCL-2家族中的BCL-2[29]。BCL-2家族中还有其他蛋白[26,45]，简单可分为三类：①BAX、BAK：为凋亡效应蛋白，受凋亡信号激活后，寡聚化形成通道，使细胞色素c外流至胞质中引起细胞凋亡；②抗凋亡蛋白：包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、BCL2A1、MCI-1[45,46]等，识别并配对于BAX / BAK的BH3结构域中，阻止其聚合，从而发挥抗凋亡效应；③BH3-only蛋白：包括BIM、BID、PUMA、BAD、HRK、NOXA[27]等，不但可于抗凋亡蛋白结合，阻止其结合至BAX / BAK的特定位点，还可以直接激活外膜上的BAX / BAK蛋白，使其发生寡聚化，发挥促凋亡作用。
线粒体内往往发生着复杂而精密的变化，BCL-2家族蛋白之间时刻维持着动态平衡，BH3分析是为研究21种已知的BCL-2家族蛋白成员之间相互作用而开发的分析工具，其原理是通过量化暴露于各种促凋亡蛋白后线粒体的去极化数量来评估线粒体凋亡通路的启动[47,48]。其优点是可以在活细胞内观察小分子药物的作用过程，研究细胞对BCL-2家族成员的依赖性。本实验采用BH3分析不仅可以精准地分析细胞对BCL-2家族中不同促凋亡蛋白或者抗凋亡蛋白竞争性抑制剂的敏感性，还可以研究细胞线粒体内BCL-2家族蛋白的相互作用，探明线粒体凋亡路径的走向。
2 实验材料及仪器
2.1 实验细胞
本实验所用AML细胞株MV4-11, MOLM13, OCI-AML2, OCI-AML3, KG1α, THP-1均为人源细胞系，且通过细胞系短串联重复序列（Short Tandem Repeat, STR）[50]鉴定,其中MOLM13，KG1α, THP-1来自广东省人民医院血液科实验室库存，MV4-11, OCI-AML2, OCI-AML3购自浙江美森细胞科技有限公司。各细胞系供者的基本资料等信息见表1-1。
后续实验所用维奈克拉耐药株均有本实验室通过低浓度持续诱导法诱导MV4-11, MOLM13, OCI-AML2产生耐药，耐药细胞株分别命名为MV4-11-R, MOLM13-R, OCI-AML2-R。
第三章 转录组代谢组双组学联合分析线粒体代谢变化 .................... 31
1 引言 .............................. 31
2 实验材料及仪器 .............................. 32
第四章 在耐药细胞中敲除ADAM15 对细胞功能的影响 ................. 45
1 引言 ........................ 45
2 实验材料及仪器 .............................. 46
第五章 综合讨论 ................... 61
第五章 综合讨论
本实验首先筛选了对维奈克拉敏感的AML细胞系，然后用低浓度持续诱导法诱导形成维奈克拉耐药AML细胞株，并对其展开后续研究。一方面，BH3分析显示维奈克拉耐药细胞株对BCL-2家族不同蛋白的敏感性从一开始的对BCL-2依赖变为对BCL-2家族其他蛋白的依赖（如MCL-1, BCL-XL等），进一步的qPCR 结果表明其依赖性的转变与蛋白表达水平的改变有关，但不一定呈正相关，需综合分析抗凋亡蛋白与BH3-only蛋白的相对表达量，此结果进一步验证了耐药细胞系的构建成功以及耐药机制的复杂性。同时，BH3与基因表达结果综合分析可阐明BCL-2家族蛋白表达谱的改变与线粒体凋亡的走向之间的关系。对于临床上应用维奈克拉的患者耐药前后基因表达改变的分析表明，其基因表达与本实验在细胞系中观察到的结果具有一致性，另一方面，为了探究引起这种抗凋亡蛋白依赖性改变的上游通路，本实验进行了细胞转录组与代谢组联合分析。应用生物信息学方法与统计学原理，本实验分析了DEGs的交集、主要富集的通路等，对差异代谢物的交集、聚类分析及其富集通路分析表明[69]，氨基酸代谢在耐药细胞中可能更为活跃。联合分析主要集中在寻找差异代谢物与DEGs共同富集的通路，以及对二者的相关性分析，结果表明，差异基因ADAM15与差异代谢物2-甲基丁酰肉碱及共同差异代谢物具有显著相关性。初步功能研究表明，添加2-甲基丁酰肉碱类似物能轻微增强敏感细胞对维奈克拉的抗性。对ADAM15表达量进行分层绘制生存曲线，结果显示，ADAM15高表达与不良预后相关。再进一步实验表明，敲除ADAM15可降低耐药细胞的耐药性，并影响其细胞活性、迁移和侵袭能力，提示其可能是耐药性调控的上游因素。
第六章 结论
AML细胞对于维奈克拉的耐药性与其对BCL-2蛋白的依赖性转变密切相关。通过对转录组和代谢组的双组学分析，我们发现差异基因ADAM15与差异代谢物2-甲基丁酰肉碱之间存在显著相关性。进一步的实验表明，在耐药细胞株中敲除ADAM15后，不仅耐药性发生了改变，还影响了细胞的迁移/侵袭能力。本实验研究结果提供了 ADAM15 促进AML细胞维奈克拉耐药及功能转变的分子和细胞证据，这可能为 AML 治疗提供潜在靶点。
参考文献（略）
