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基于二代测序技术检测粪便样本中幽门螺杆菌耐药基因突变的思考

日期:2024年05月23日 编辑:ad201107111759308692 作者:无忧论文网 点击次数:38
论文价格:150元/篇 论文编号:lw202405151654459959 论文字数:48545 所属栏目:工程硕士论文
论文地区:中国 论文语种:中文 论文用途:硕士毕业论文 Master Thesis

本文是一篇工程硕士论文,本研究使用巢式PCR联合一代测序和扩增子靶向测序的方法对粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变进行了检测,并将其与碳呼气试验、粪便抗原的结果进行对比,分析粪便样本幽门螺杆菌耐药突变检测的诊断性能,同时比较巢式PCR联合一代测序和扩增子靶向测序的结果,分析NGS技术用于粪便样本幽门螺杆菌耐药突变检测的可行性。

1 绪论

1.1 研究背景与意义

1.1.1 幽门螺杆菌概述

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一种微需氧的革兰氏阴性螺旋状致病菌,定植于宿主的胃黏膜上皮细胞部位(图1-1),据统计全球已有约50%以上人口感染幽门螺杆菌[1, 2]。1982年,Warren和Marshall首次从消化病人的胃组织中分离培养出了这种细菌,彻底改变了既往临床上对胃部疾病的认识和治疗方案[3]。幽门螺杆菌的致病机制是通过鞭毛的动力使其穿透胃黏液层到达胃黏膜上皮细胞,依靠自身分泌脲酶中和周围的酸性物质,将周围的pH维持在6.1左右,使其可以在胃部恶劣的酸性环境(pH<2)中存活[4, 5]。同时,幽门螺杆菌定植胃黏膜后会产生许多毒力因子,如细胞毒素相关蛋白A(cagA)、空泡细胞毒素A(vacA)、前炎症外膜蛋白A(oipA)等[6],从而不断引发宿主对感染部位的细胞和体液免疫反应,导致持续的炎症反应[7]。几乎所有的幽门螺杆菌菌株均能产生vacA,后者被认为是幽门螺杆菌最主要的毒力因素之一,与胃的病变严重程度有很大的相关性[8]。因此,无可争议的是,幽门螺杆菌与全球沉重的胃部疾病负担有关。

幽门螺杆菌的感染是非常普遍的,其患病率在一些社会经济较差的发展中国家更高,在某些地区甚至会超过90%[9]。密切的人际接触,尤其是同住人员,已被证实对幽门螺杆菌的传播具有密切的联系,但人与人之间的传播尚且不明确[10]。目前认为幽门螺杆菌在人群中最可能的传播途径是口-口、胃-口和粪-口三类,口腔是其进入人体的唯一途径[11]。在发达国家和发展中国家,幽门螺杆菌感染通常发生在宿主的儿童时期,并持续到成年,通常与家庭聚集、教育水平低下和卫生条件差等有关[12]。

1.2 粪便样本中幽门螺杆菌耐药突变的检测方法

粪便样本中会存在一些抑制基于PCR检测的物质,如血红蛋白及其降解产物、多糖复合物、重金属和蛋白质等[95]。再加上幽门螺杆菌是特异性地定植于胃中,不属于肠道细菌,因此它在粪便中是微量存在的[79],这些因素可能会对使用粪便样本检测幽门螺杆菌的灵敏度产生影响。因此,直接从粪便标本进行幽门螺杆菌和耐药性检测可能在很大程度上取决于所使用的DNA提取方法和PCR测定方法[26]。所以需要目前的分子检测方法大多聚焦于先通过PCR对样本中的模板DNA进行扩增后再采取基因分型的办法对突变进行检测。

1.2.1 PCR限制性片段长度多态性技术

PCR限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)是最早开发的基于PCR扩增检测靶基因的方法之一。其原理是扩增含待检测突变的目的基因片段,然后使用能特异性切割突变位点的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物,片段大小说明了特定突变的存在/不存在[85]。以23S rRNA为例,可使用三种不同的限制性内切酶BcefI 、Bbs I和Bsa I分别对三种最常见的点突变(A2142C、A2142G和A2143G)进行检测[96]。Fontanta等[97]报告了使用PCR-RFLP方法检测幽门螺杆菌23S rRNA突变的方法。Booka等[98]利用PCR-RFLP技术,对粪便幽门螺杆菌克拉霉素耐药突变进行了检测,耐药率为31%(5/16)。因此,通过使用PCR-RFLP检测幽门螺杆菌耐药性,有助于在短时间内制定根除幽门螺杆菌的方案。但不幸的是,虽然可以检测到A2142G或A2143G的简单突变,但在混合感染的情况下很难表现出明确的限制性酶切模式[99]。并且有几个因素限制了它的临床应用,包括低通量、操作复杂和污染的风险[100]。

2 不同粪便样本提取方法效果的比较

2.1 实验材料

2.1.1 实验仪器

目前市面上已经开发出了多种粪便样本DNA提取试剂盒,为了评估出粪便样本中DNA提取效果最好与最适合开展的方法,本章节比较了3种商业试剂盒的提取结果,即HiPure Stool DNA Mini Kit、Stool DNA Extraction Mini Kit C、QIAamp® PowerFecal® Pro DNA Kit,这三种试剂盒均是基于离心柱的硅胶DNA分离技术。收集5份不同样来源的新鲜人粪便样本后将其充分混匀,保证分装后的每一份样本具有高度均一性,使用上述3种试剂盒对粪便样本进行DNA抽提,提取后得到的DNA样本采用Nanodrop、Qubit和凝胶电泳对提取的DNA质量进行评价。

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2.2 实验方法

2.2.1 不同试剂盒粪便DNA抽提

如图2-1所示,本研究将收集的5份粪便样本分别进行混匀后,每个粪便样本均取等量3份(150mg/份)标本,分别利用表2-4所示的3种基于离心柱法的试剂盒进行提取。具体的DNA提取操作根据说明书步骤进行,主要包括均质化、去除沉淀(粪便颗粒)、取上清、吸附、洗脱等。

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3 巢式PCR联合一代测序检测粪便幽门螺杆菌耐药突变 ................. 28

3.1 实验材料 ................................. 29

3.2 实验方法 ............................ 31

3.3 结果与讨论 .......................... 36

4 多重扩增子靶向NGS检测粪便幽门螺杆菌耐药突变 .................... 48

4.1 实验材料 .................................... 48

4.2 实验方法 ....................................... 50

4.3 结果与讨论 ................................. 55

5 主要结论与展望 .................................... 68

5.1 主要结论 ............................ 68

5.2 展望 ............................................ 69

4 多重扩增子靶向NGS检测粪便幽门螺杆菌耐药突变

4.1 实验材料

4.1.1 实验仪器

工程硕士论文参考

5 主要结论与展望

5.1 主要结论

利用分子生物学的方法检测幽门螺杆菌抗生素相关基因的耐药突变,是实施幽门螺杆菌精准根除治疗的主要凭借手段,有助于提高提高根除率。另一方面,胃部的幽门螺杆菌可随粪便排出,与胃黏膜相比,利用粪便样本进行幽门螺杆菌耐药突变检测具有采样方便、无创等特点,有利于幽门螺杆菌精准根除治疗的推广实施。本研究使用巢式PCR联合一代测序和扩增子靶向测序的方法对粪便中幽门螺杆菌耐药基因突变进行了检测,并将其与碳呼气试验、粪便抗原的结果进行对比,分析粪便样本幽门螺杆菌耐药突变检测的诊断性能,同时比较巢式PCR联合一代测序和扩增子靶向测序的结果,分析NGS技术用于粪便样本幽门螺杆菌耐药突变检测的可行性,主要结论如下:

(1)将三种粪便DNA提取试剂盒抽提出DNA的浓度、纯度和凝胶电泳条带分别进行统计分析显示,不同试剂盒提取的DNA纯度(P = 0.646)和Qubit测定的浓度(P = 0.154)没有显著差异,而通过Nanodrop测定的浓度结果显示,3个试剂盒抽提的DNA浓度存在显著差异(P = 0.046)。综合考虑,Magen试剂盒用于粪便样本DNA提取的效果最佳。

(2)两步法巢式PCR联合一代测序可以灵敏地检测到粪便样本中的幽门螺杆菌的目的片段,不仅可以检测幽门螺杆菌的感染状况,同时也可用于幽门螺杆菌的耐药突变检测。结果显示,在135例粪便样本中,共检出63例幽门螺杆菌阳性样本。幽门螺杆菌23S rRNA耐药突变率高达65.08%,gyrA耐药突变率为38.10%,四环素16S rRNA耐药突变率为9.52%,呋喃唑酮耐药突变率为37.93%。本研究的抗生素耐药突变率总体偏高,可能是研究样本量较少,系样本选择偏差所导致,需要进一步扩大样本研究确认。

(3)与13C呼气试验和粪便幽门螺杆菌抗原检测结果为对比,巢式PCR联合一代测序粪便幽门螺杆菌基因检测的Kappa值分别为0.911和0.880,AUC值分别为0.955和0.946。这些研究结果提示,粪便幽门螺杆菌耐药基因检测具有很高的诊断价值,可以作为幽门螺杆菌感染患者的新型非侵入性生物标记物,有助于提高幽门螺杆菌的根除率,从而进一步有助于降低胃癌的发病率。

参考文献(略)