本文是一篇农业论文，本研究对不同品种和不同日龄种公鸡精液品质评价，随后对种公鸡实施母鸡禁食诱导生理重塑（诱导换羽）的模型，研究生理重塑对种公鸡的精液品质和孵化性能的影响。
1 文献综述
1.1 种公鸡繁殖性能的研究进展
1.1.1 种公鸡体形外貌对繁殖性能的影响
在生产中，通常会把所有精力和关注都放在母鸡身上，但是种公鸡对整个鸡群的技术经济效果影响高达50%，必须采用相同的技术方式进行饲养，因此不能忽视它们，并为它们提供舒适的生产环境和技术管理[1]。传统的挑选优秀种公鸡的方法是根据体形外貌来选择的，体形外貌不仅是家禽品种特征，也可以作为繁育的品系特征[2]。绿壳蛋种公鸡42 d进行第一次选择，淘汰不健康的鸡和雄性特征不明显的鸡，选留符合标准、体型紧凑、灵活机敏的小公鸡[3]。陈合强[4]研究表明前期控制体重，公鸡体重均匀度下降，死淘率上升；10 W体重不达标，体重偏小的公鸡性成熟推迟；18-20 W冠发白、萎缩、发育不全导致开产前受精率较低，孵化率上升慢，开产后公鸡很快变肥超重。优秀种公鸡的性状表现为鸡冠、肉髯及眼睛四周颜色红润而均匀，肛门红润、鸣叫洪亮、站姿良好，腿部、脚部、脚趾良好、背部平整、羽毛覆盖良好[4]。肉用种公鸡培育的目标：体型大，体格健壮，胸部肌肉丰满而平坦，脚趾正常，结构均匀，羽毛有光泽，冠大而颜色红润，冠型直立而丰满，眼睛亮而有神，雄性特征明显，有良好性反射，体型体重符合品种要求的健康公鸡[5, 6]。随着年龄的增长，种公鸡鸡冠倒伏，两眼无神，精神萎靡，羽毛杂乱无光泽，此时的种公鸡较之前表现出更差的繁殖性能，导致孵化率，健雏率下降，所以说要重视种公鸡的体形外貌，种公鸡的体形外貌是影响家禽业以及繁殖性能的重要因素之一，对种公鸡的外貌进行全面的评价和选择，有助于提高家禽业的生产效益和经济效益。
1.2 禁食诱导生理重塑的研究进展
1.2.1禁食诱导生理重塑（诱导换羽）的原理及方法
应激是一种反应模式，是指动物机体受到外界或内部不良因素刺激后，所产生的一系列非特异性应答反应[23, 24]。近些年，人们研究发现，应激可以很大程度上改变畜禽的生产性能、繁殖性能等。禁食诱导产生的饥饿属于应激中的一种，在家禽生产中常对处于产蛋后期的母鸡实施禁食诱导换羽。换羽是鸟类应对季节变化的一种自然生理现象[25, 26]。自然换羽一般需要4个月的时间，严重影响经营者的经济效益[27]。然而，诱导换羽（IM）只需要4 W即可完成，IM是指人为的将压力因素施加在母鸡身上，导致其生殖系统发生独特的形态和生理变化，使母鸡在短时间内停止产蛋并失去羽毛和体重的方案[28]。强制换羽就是利用化学或者饥饿的方法降低鸡的采食量，使其营养摄入不足特别是钙的摄入，进而改变下丘脑调节功能，抑制脑垂体的促性腺激素分泌，令其体内营养物质自我分解，尤其是脂肪，导致鸡的体重减轻和生殖系统萎缩，促进换羽[29]。市场上常常采用人工强制换羽的方法来控制母鸡的产蛋时间，恢复产蛋性能[30-33]。IM常用的方法是禁食、激素、化学等方法，禁食法由于其操作简单，成本低，效果明显，是IM最流行的方法[34, 35]，也最受养殖户的青睐[36]。
1.2.2 禁食诱导生理重塑在生物中的应用
禁食是世界上最古老的传统之一，在我国自古便有“过午不食”、“辟谷”等说法。近年来，“间歇性禁食”也受到科研届的广泛关注，对包括限食禁食、隔日禁食、周期性禁食、5：2饮食法等在内的禁食方法进行了诸多研究。饮食干预可定期减少或去除热量摄入或特定饮食成分，从而有力的促进健康和长寿[37-40]。
3 试验一 年龄对种公鸡精液品质的影响和生理重塑模型构建
3.1 试验材料
3.1.1 试验动物及设计
试验选取健康且体重均一的25W和50W“豫粉1号”H系（H系）、矮脚绿壳蛋鸡（矮绿）、矮脚贵妃鸡（矮贵妃）三个品种各15只鸡，试验鸡只由河南农业大学家禽种质资源场提供，在同一条件下饲养。试验前一周，每隔1天，对试验鸡只进行腹部按摩采精训练，对25W和50W三种品系的种公鸡进行精子活力和精子密度的检测。同时为解决50W种公鸡精液品质下降的问题，借鉴母鸡禁食诱导生理重塑的模型，选取50只 50W健康且体重均一的矮贵妃种公鸡（河南农业大学家禽种质资源场），以时间轴为对照，本实验共有5个关键时间点（表3-1 F0（断料第一天的前一天）；F10（断料第10天）；F15（断料第15天）；R15（恢复喂料的第15天）；R32（恢复喂料的第32天），公鸡的屠宰时间是通过参考前人对母鸡强制换羽的研究[102]。在上述的5个关键时期选择3-5只种公鸡静脉放血处死，保存睾丸样品，部分睾丸置于-80℃ 低温冰箱中保存，部分睾丸置于4%多聚甲醛中保存用于后续切片。
3.2 试验方法
3.2.1 体重测量
禁食诱导期间每三天称重一次，恢复期间每四天称重一次（称重时间结合屠宰实际），精确到0.001 kg，并计算每只鸡的失重率，精确到0.01%。 失重率（%）=（F0体重-每次称重）/F0体重×100。
3.2.2 精液品质测量
采精时间为下午3点，采精前禁食3小时。1人保定公鸡，使其双腿自然分开，固定好翅膀，并且让鸡头后仰，尽量达到自然交配的姿势。1人用手轻轻抚摸公鸡，从翅根到尾羽，刺激公鸡，而后一只手迅速使尾羽背向，另一只手分开泄殖腔，并用手轻轻剐蹭泄殖腔下缘，精液流出时，用1.5 mL 离心管接取并做好标记，紧握于手心中。采到的精液立刻置于37℃水温的水浴锅中，30 min内用完（或采到的精液放置于提前配制好的稀释液）。
精子活力和精子密度：将收集的精液与0.9%的氯化钠溶液以1:500进行稀释，取10 μL混合液，滴在汤麦式血细胞计数板上，盖上盖玻片。在40X显微镜下进行观察计数，取计数室4个角和最中心的正方形中的精子数（对于压在正方形界限上的精子应当计相邻两边及其夹角上的精子）作为该正方形的精子总数，再以此方法统计呈前进运动精子数，从而计算出精子密度、精子活力，以上计数工作全部由同一个人完成。精子密度=精子总数/80×500×400×10000；精子活力（%）=呈直线运动精子数/精子总数×100。
3 试验一年龄对种公鸡精液品质的影响和生理重塑模型构建 .......... 13
3.1 试验材料 ........................ 13
3.1.1 试验动物及设计 ........................ 13
3.1.2 试验试剂和设备 ............................... 13
4 试验二生理重塑模型在不同品系种公鸡中的应用 .......................... 23
4.1 试验材料 .............................. 23
4.1.1 试验动物及设计 ....................... 23
4.1.2 试验试剂和设备 ....................... 23
5 试验三转录组和代谢组筛选禁食诱导种公鸡精子发生重塑的关键基因和代谢物 .................. 30
5.1 试验材料 ................................ 30
5.1.1 试验动物及设计 ......................... 30
5.1.2 试验试剂和设备 ............................ 30
6 试验四 禁食诱导对种公鸡精子发生重塑的影响机制
6.1 试验材料
6.1.1 试验动物及设计
本试验用到的材料同3.1.1。一份于-80℃保存用于后续qRT-PCR，一份于4%多聚甲醛中保存用于后续免疫组化和免疫荧光等试验。
6.1.2 试验试剂和设备
6.1.2.1 主要试剂
Trizon Reagent（Ambion）、氯仿（国药）、异丙醇（上海化学试剂有限公司）、无水乙醇（广州化学试剂厂）、RIPA裂解液（碧云天）、BCA蛋白定量试剂盒（上海雅酶）、SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒（碧云天）、脱脂牛奶（伊利）、二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）、EDTA（PH8.0)抗原修复液（武汉百仟度生物）、PBS缓冲液（武汉百仟度生物）、一抗稀释液（武汉百仟度生物）、BSA（牛血清白蛋白）（DAKO）、抗荧光淬灭封片剂（武汉百仟度生物）。
6.1.2.2 主要仪器
7 全文总结
（1）通过比较不同品种种公鸡25 W和50 W的精液品质发现，随着周龄的增加，不同品种种公鸡的精子密度和精子活力降低，为解决种公鸡因年龄导致的繁殖性能衰退的现象，借鉴母鸡的禁食诱导生理重塑模型，通过比较禁食诱导前（F0）、中（F15）、后（R32）矮贵妃种公鸡的体重、睾丸重、精液品质，发现禁食诱导后体重、睾丸重、精子活力和孵化性能恢复至F0水平（比禁食前略高），但精子密度没有恢复至禁食诱导前的状态。
（2）为验证禁食诱导生理重塑模型的适用性，选择非矮小型和正常型种公鸡进行禁食诱导生理重塑试验，发现禁食诱导在矮小型鸡和正常型鸡中都适用，由此可见，成功构建种公鸡的禁食诱导生理重塑模型，禁食结束应控制失重率在25%以内，恢复周期大于32天更佳。
（3）为揭示禁食诱导种公鸡精子发生重塑的调控机制，对F0、F15、R32矮贵妃种公鸡的睾丸组织进行转录组学和代谢组学测序，通过多组学联合分析，富集到类固醇激素生物合成等通路。
（4）紧紧围绕睾丸中最重要的类固醇激素（睾酮）开展内在调控机制的探究，发现F15睾丸中睾酮、促卵泡激素含量上调，血睾屏障相关蛋白上调且血睾屏障被破坏，减数分裂也被破坏，R32睾酮含量，血睾屏障恢复正常水平。
参考文献（略）
